Biomonitoraggio ambientale con approcci di terza generazione: Digital Droplet PCR per la quantificazione di biomarcatori/bioindicatori e tecnologia Nanopore per il sequenziamento

Thursday 1 Jun 2023, 14:30 → 16:00 Europe/Rome

Seminari IRSA-2023

 

Biomonitoraggio ambientale con approcci di terza generazione: Digital Droplet PCR per la quantificazione di biomarcatori/bioindicatori e tecnologia Nanopore per il sequenziamento

 

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BRUNA MATTURRO

CNR-IRSA Roma

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Il biomonitoraggio (bm) è uno strumento essenziale per diverse applicazioni ambientali. Ad oggi le metodologie biomolecolari sono ampiamente usate per il bm consentendo di analizzare geni, microrganismi e comunità microbiche con approcci coltura-indipendenti (environmental-omics) che consentono di individuare e studiare in tempi rapidi anche la frazione microbica non coltivabile. Per la quantificazione di bioindicatori/biomarcatori di diversi processi ambientali, negli ultimi quindici anni la Real Time PCR (qPCR) è stata ottimizzata, validata e applicata con successo quale metodologia elettiva. Tuttavia, il limite di rilevabilità è un punto critico della qPCR che può generare risultati fuorvianti in particolare con concentrazioni di targets ≤ 1E+03 copie geniche/reazione. Inoltre, la necessità di allestire rette di calibrazione ed eseguire reazioni in triplicato, rende talvolta questo approccio time-consuming. Per superare i limiti di accuratezza, sensibilità, precisione e riproducibilità della qPCR, abbiamo sviluppato e ottimizzato protocolli di Digital Droplet PCR (ddPCR) per il bm di geni coinvolti in diversi processi ambientali dal biorisanamento, alla valorizzazione di sostanze di scarto per la produzione di biocomposti ad alto valore aggiunto, all’antibiotico resistenza. Per il set di targets analizzati, è stato valutato il range dinamico di risposta della ddPCR rispetto alla qPCR e i dati ottenuti su diverse tipologie di campioni saranno discussi in questa presentazione, evidenziando le potenzialità della ddPCR ai fini del biomonitoraggio.

Un ulteriore elemento essenziale per il bm è la caratterizzazione della composizione/funzionalità di microbiomi mediante sequenziamento finalizzato all’analisi (meta)genomica/trascrittomica. Nei primi anni 2000, il sequenziamento high-throughput ha mosso i primi passi consentendo, soprattutto su piattaforma Illumina (basata su short-read sequencing), di fare luce nella black box microbica evidenziandone le potenzialità per molti processi biologici di interesse ambientale. Sebbene il sistema di sequenziamento Illumina sia valido ed altamente efficace, per alcune applicazioni in tempo reale e on-site dimostra delle criticità, soprattutto se non si dispone di genomi di riferimento. Recentemente è stata sviluppata la tecnologia di sequenziamento Nanopore (basata su long-read sequencing) con elevata rapidità di esecuzione e con strumentazione agevole per applicazioni in real-time e on-site. Nella presentazione verrà riportata l’esperienza maturata su entrambe le piattaforme di sequenziamento, discutendone le potenzialità per rendere il biomonitoraggio uno strumento di routine, soprattutto nell’ottica di integrare la genomica ambientale in sistemi di machine learning finalizzati a decifrare i dati –omici e tradurli in azioni a supporto delle fasi gestionali e decisionali di problemi ambientali in sistemi naturali o ingegnerizzati.

 

I partecipanti registrati riceveranno un link personale per connettersi mediante la piattaforma GoToMeeting.

 

 

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